將離心后的上清留取少量樣品后（所留樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，混合后，于100℃煮沸5 min，離心后放置-20℃保存備用），對蛋白含量進行定量，補充Lysis/IP buffer至1 ml左右，然后分別加入50μl 50％的Progein G beads，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h以除去Protein G beads非特異結合的蛋白。
于4℃，13,000 rpm離心5 min，將上清液再次轉移至1.5 ml EP管內，加入1μl的正常小鼠IgG或者是FLAG單克隆抗體，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h，使抗體與蛋白進行特異結合。
加入50μl 50％的Protein G beads，于4℃環境下，將EP管固定到混勻器上使混勻器勻速顛倒旋轉1 h，使Protein G beads與抗體結合。
